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123仪器商城文章中心之各种色谱方法的原理

2010-12-22

123仪器商城文章中心之各种色谱方法的原理
1、气相色谱
用于GC分离的组分为气态或加热后呈气态，在气相中传质速度快，与固定相互相作用次数多。因此，GC具有高分离交通和高选择性，采用了灵敏的检测装置，故GC具有高灵敏度。
高选择性是指GC能分离性质极为相近的组肆，如分离同位素和同分异的构体等到。氢原子有3个同位素：氢（H）、氘（D）、氚（T），可组成6种氢分子，在GC上也能分离出来。有机物同分异构体包括几保异构、旋光异构等。青霉素胺是铅中毒的排毒剂，有两个不对称碳原子的旋光异构体：有右型（D-）和左型（L-），D-青霉素按有药效作用，而L-青霉素胺有很强毒性，故要求只含有D-青霉素胺，通过毛细管气相色谱法可以检查出来。
GC的高分离效能是指能分离很复杂的混合物。利用气相毛细管色谱分离某轻质原油中的7个碳到28个碳的烷烃。
GC的高灵敏度是指气相色谱可以测定含量低于10g的组分。某地天然气泄漏，用GC可以测到植物中含10个碳到32个碳的烃类残留。
吸附剂的种类很多，但能作为气固色谱固定相的吸附剂却不多，仅有前面提到的几种。吸附剂的性能与其制备、活化条件有很大的关系，所以分离效果不能重复，而且常在高温下操作，阴附剂本身对分离组分有催化作用，因此气固色谱的应用受到某些限制。
气液色谱的固定相是由惰性载体和涂渍在载体上一层高沸点有机化合物薄膜组成，载体和固定液对组分离起决定性作用。载体要能牢固定液、均匀地吸收住固定液，而要分离的组分必须能溶解在固定液中。因组分之间的沸点、熔点、溶解度、汽化热、表面张力不从心黏度等理化性质的差异决定了这些组分在固定相中“溶解”的差异，经过多次地溶解与析出，这些组分才得以分离。
气液色谱的样品量少，仅几微升，样品中的组分在固定相和流动相中的分配浓度都是线性相关的，性能优于气固色谱，20世界50年代一经问世，气液色就以惊人的速度获得广泛的应用。
毛细管固色谱是在毛细管内壁表面涂敷一层吸附剂作为固定相，称为多孔层毛细管柱。
毛细管气液色谱的固定液直接涂渍在毛细管内壁表面上称涂层毛细管柱；在内壁上先涂敷载体，再在载体上涂渍固定液的称载体涂渍固定液的称载体涂层毛细管柱。
早先采用均匀的铜管、铝管、玻璃管、离聚物管等做毛细管柱，一般的长度为20m左右，内径为250um左右。
现在多采用石英弹性毛细管，不再用机械涂渍的方法涂渍固定液，而是将高沸点固定液分子的基团与石英毛细管内壁的硅醉或硅醚基团发生化学反应键合起来。这样键合的固定相比机械涂渍更牢靠。
2、液相色谱
液相色谱，就是液相吸附色谱，选用的吸附剂不能被液体流动相溶解，有足够的比表面积，有一定的吸附能力。茨维特用碳酸钙做固定相，石油醚做流动相，就是典型的液固色谱。通常固定相表面含有极性基团，如硅胶，而分离的组分含有亚极性基团，不溶于极性溶剂（水等）和非极性溶剂（醚、酯等）。用非极性流动相冲洗，要分离组分的亚极性基团与固定相极性基团相互作用；使得组分被吸附住，而非极性流动相又与要分离组分相互作用，冲洗这些组分离开固定相。这些分离组分存在理化性质差异，后被分离开来。
例如抗心绞痛药物乙胺碘呋酮含有碘基、叔胺基等亚极性基团，采用硅胶柱，氯仿-甲醇-氨水（497：3：0.25）为流动相做液固色谱法测定，很有效地监护了心绞痛病人的临床用药。
液液色谱现在就是化学键合相色谱，用化学的方法将固定液键合到载体的表面上。常用硅胶或有机高聚物为载体，以硅胶为例：硅胶键合相和有机高聚物键合相示。（A）封尾，表示用十八烷基硅烷键合后没有裸露的游离硅醇，被分离组分能有效地在固定相和流动相之间连续按比例分配。（B）未封尾，表示键合不完全，存在裸露的硅醇，能对被分离组分有吸附作用，分离效果差。（C）聚合物涂渍，先在多孔有机层键合，这叫多孔有机层键合相。（D）表示硅烷直接键合在有机高聚物球表面上。
键合相色谱与传统的液液色谱相比，主要优点是化学键合相很稳定，在流动相中不易流失，能够用于梯度洗脱，可以键合不同性能化合物，能分离范围很广的各种组分。
常用的十八烷基硅烷键合硅胶，简称ODS。流动相的极性大于固定相，是典型的液相分配色谱，通常也中反相色谱。我们姑且这样认为，其实从化学观点来看反相色谱有复杂的分离机理，涉及到分离的组分、流动相和键合相三者之间的作用。
现代液相色谱分离效能高，分析速度快，检测灵敏度高，应用范围广，更适合于高沸占、大分子、极性强和热稳定性差的组分分离。现代液相色谱已经从经典的液相色谱脱颖而出，与茨维特的试验相比已不可同日而语。大家把现代液相色说命名为高效液相色谱（以下简称HPLC）。
3、离子交换色谱
离子交换色谱的技术、设备和采用的方法与其它类型的液要色谱基本相同，但分离的原理不同。要分离的的组分是离子型的，固定相是离子交换树脂，带有固定电荷的活性基团可与组分产生离子交换，因相互作用亲和力的差异，与固定相作用弱的组分不易保留，首先被子以水为主的缓冲液（流动相）洗脱下来。面与固定相作用强的组分被留在固定相上，要慢一步洗脱下来。结果样品中的组分被先后有序洗脱下来，后得以彼此分离。
离子交换色谱也已被广泛应用，在解决冶金、生物化学等诸多难题中发挥了重大作用。
离子交换树脂的交换基轩带正电荷的称阳离子交换树脂，带负电荷的称阴离子交换树脂。
离子交换剂的种类很多，常用合成脂类型如下：聚苯乙烯和二乙烯基苯交联共聚物为基质，与芳环磺化生成强酸笥阳离子交换树脂，或者与芳环进行季铵盐化生成强碱性阴离子交换树脂。还有弱酸性、弱碱性、两性离子交换剂等。这些离子交换剂有较大的溶胀性，不耐高压而且多孔，不适宜装在HPLC的术缺点，获得较好的分离效能。几种以硅胶为基质的离子交换剂的健合相列。离子交换色谱的流动相以水溶液为主，一般配缓冲液以担供平衡的反离子，使流动相保持一定的离子强度和pH值。也可加人甲醇，乙腈等有机试剂，性病组分的溶解性能和选择性，克服色谱峰的尾现象。
4、凝胶色谱
凝胶色谱双称排阴色谱，也是近年发展起来的一种新型色谱，可以形象地比喻为筛子色谱。固定相为具有不同尺寸孔径的多孔凝胶。这些孔对流动相的分子来说足够大。它们可以自由地扩散出入。要分离的组分一般为高聚物，虽然这些大分子也能在孔中扩散但不那么自由。大个儿的分子扩散速度慢且占据的孔少，小个儿的分子扩散速度快占据的孔多，还能占据大个儿分子进不去的小孔。分子个儿小越小可占据孔的体积越大。当流动相通过时，在个儿分子受到的推力大，先从凝胶的大孔中跑出来，小个儿的分子比大个儿的分子在凝胶孔中停留的时间长，更小个儿的分子停留的时间更长，于是要分离组分的分子依尺寸由大到小的顺序流出色谱柱。
用于凝胶色谱的固定相分两类，一类为有机凝胶，另一类为无机凝胶。
有机凝胶分离效果好，但热稳定性、机械强度和化学惰性差，使用寿命短。有机凝胶有交联聚苯乙烯、交联聚乙酸乙烯酯、交联葡聚糖等。其中交联聚苯乙烯性能较好。
无机凝胶分离效果差一些，但性能稳定。与有机凝胶相比无机凝胶的热稳定性、机械强度、化学惰都好，使用寿命长。大的优点是使用不同的溶剂做流动相，无机凝胶的颗粒、孔径尺寸皆稳定。无机凝胶有多孔硅胶、多孔玻璃球等。
凝胶色谱主要用于高分子聚合物的分离聚合物的分离，因此对溶剂的选择不像其它色谱那样苛刻。组分的分离不是依赖于流动相和组分之间的相互作用，而是依赖于配制流动相的溶剂对高分子聚合物组分的溶解能力。只要纯度高、腐蚀性低、溶解性能好、黏度低的溶剂都能用来配制凝胶色谱的流动相。像4氢呋喃、氯代烷烃、苯酚、取代芳烃等都可选择作为配制凝胶色谱流动相的试剂。
用凝胶色谱分离高聚物目的是测定分子量分布范围和纯度，测定品种范围很广，如一般高聚物聚苯乙烯、纤维素、橡胶、聚氨酯、涤纶、尼龙等。现在凝胶色谱已向生物化学、无机化学等方面渗透，应用范围不断扩大。
5、薄层色谱
薄层色谱也称平板色谱，其分离原理与液相色谱相同，故也属于液相色谱范畴。薄层色谱的固定相为硅胶、氧化铝、聚酰胺等极性物质，现在也用硅胶为载体的键合相。加黏合剂或不加黏合剂用调制成糊状，根据需要还可以加入少量乙醇有助于糊状物均一气泡，平铺糊状在玻璃板上，阴干后在烤箱内用合适的温度活化。在薄层板的下端用毛细管定量点样，再将点样过的薄层板放在带盖的玻璃展开槽中用展开剂（流动相）展开。必须用能溶解所有要分离组分的溶剂配样品，点样点不能没入展开剂中，展开槽要密闭，使其中保持饱和的展开剂的蒸气压。选用的展开剂应根据固定相和组分的性质，可以是偏极性或非极性，也可由几种溶剂混合组成，类似于下相色谱和反相色谱那样的原理。
靠固定相间毛细渗透作用，展开剂带着点样点中的组分慢慢上升（也有下行），经过吸附、脱附或反复分配等到过程，样品中的组分获得彼此间的分离。用紫外灯、荧光灯、显色剂显色可以看到被分离组分的不同颜色斑点。用在同一块薄层板上的标准对照品相对照可以获得定性的结果。也可以刮下要定量组分的斑点（显色剂显色的斑点误差大）用溶剂洗脱下来与标准品对照用比色法定量。现在有了薄层色谱自动扫描仪，展开以后可直接定性定量。
如果采用细粒度（3 ~ 5um）颗粒均匀的固定相制成薄层板叫高效薄层色谱，分离效果更好。
薄层色谱简单而快速，已广泛用于各种领域的研究，特别对中草药活性成分的预测，用于液相色谱方法先导等往往起到事半功倍的作用。
6、纸色谱
纸色谱是以滤纸为固定相，与薄层色谱一样的点样方法和展开剂，用上行法或下行法靠滤纸的毛细管表面张力使得组分移动而分离，也和薄层色谱一样是一种液相色谱。纸色谱曾经在植物化学的研究中被广泛应用。
这里顺便提一下薄层色谱和纸色谱的如何定性的。从点样到分离组分斑点中心的距离除以从点样到展开剂前沿的距离所得的值称为比移值Rf(rate of flow)。在一定的色谱条件下每个组分都有一定的Rf值。如果在一块薄层色谱板上或同一张滤纸上出现了一个斑点的Rf值与标准对照品的Rf值一样，可以认为混合试样中含有与标准对照品一样的组分。
市场上曾有人用特制过士豆冒充中药天麻，用猪胆冒充熊胆。只要用天麻的有效成分天麻素和熊胆的有效成分牛熊氧胆酸在薄层色谱或纸色谱点样展开对照便可戳穿西洋镜。
7、毛细管电泳
毛细管电泳（CE）是一种新型的分析方法，是电泳和液相色谱二者结合的技术。
毛细管电泳的特点是：样品用量少，纳升级就可以了；不用载体可直接在缓冲液（载体电介质中分离；溶剂用量少；可分离组分的分子量范围宽；溶解样品的溶剂品种多，不受限制；分离效率高。
毛细管电泳以电泳为基础。电解质中带电的粒子（组分）在电场的作用下以不同的速度向电荷相反的方向移动的现象称为电泳。电泳使带有不等电荷的不同组分得以分离。
经典电泳大缺点是两端升高电压会引起电介质离子流自热，使载板中心到两侧产生黏度梯度和速度梯度，导致区带加宽，分离效果差。因而不能用高电压，由此限制了电泳的使用场，全面改善分离效率。
8、毛细管电色谱
毛细管电色谱是HPLC与毛细管电泳的有机结合，是用电渗流或电渗结合压力流推动相的色谱方法，是被分离组分与固定相间相互作用占主导地位的电泳过程。一仅克服了HPLC中压力流造成的峰不对称效应，而且柱内无压降，获得了近于毛细管电泳的分辨率，又具有HPLC的选择性。
毛细管电色谱分填充式毛细管电色谱和开管式毛细管电色谱。前者采用键合相填料填充到1—2mm的玻璃管中拉制而成，或者直接将填充进毛细管柱中。后者将化学物质直接键合到毛细管柱的内壁上。
因毛细管电色谱采用电渗流和压力流推动流动相，所加高电压易损伤HPLC的动力系统，也可能给操作者造成意外伤害。这是毛细管电色谱缺点。
至此，归纳一下色的分离原理：混合物中的组分在流动相的推动一通过固定相，不同组分的分子以不同的平均速度移动而分离。而同一种组分的分子在固定相间也会扩散，不会一刀切地同是离开固定相。所以，组分的分子有两种移动：不同组分的分子移动和同组分的分子间扩散移动。扩散移动速度远远低于不同组分的分子沿色谱柱方向的移动速度。只有满足了这一条件，混合物中的组分才能彼此间分离。所有类型色谱的分离都遵循这个原理。