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高科技检测仪器之荧光检测器

2010-12-24

                                                 高科技检测仪器之荧光检测器
     荧光是一种特殊类型的发光现象，是分子被电磁波辐射后产生的光，也称光到发光。
     吸收能量的分子中的电子被激发从低能阶到高能阶，在跃迁的过程中电子吸收能量使紫外光的强度降低。这就是紫外吸收检测器的原理。如果电子吸收了多余的能量冲出了紫外吸收的范围到达更高的能阶，在回到低能阶的路途中因与其它分子的碰撞或其它原因，这些高能电子不会很快消失，当它们到达一个特定次高能阶时一下子降到一个特定的次低能阶，这个过程产生的光就是荧光，亦发射荧光。
    电子碰撞后失去了一些能量，故发射荧光（em）的总比激发荧光（ex）的波长长。激发荧光的能阶常与紫外吸收的能阶相同或相近。
    荧光检测器不像紫外吸收检测器那样设计成直通光，这样避开了激发光和发射荧光之间的干扰，多数采用90°角的光路，所用灯与紫外吸收检测器的灯相同，一般用氙灯，也是光电倍增管作为敏感器。
    有一种增强型凹镜式荧光检测器，反射性的样品池安装在凹面镜的中央，光源通过凹面镜的狭缝照到样品池上，样品池的一面不透光而将光线反射到凹面镜上，经聚焦照射到光电倍增管上，避免了激发光通过样品直射击到光电倍增管，不但增强了输出信号，而且防止了干扰。
    荧光检测器有极高的灵敏度和良好的选择性，其灵敏度比紫外吸收检测器高出10～1000倍，而且需要的样品量少。许多化合物芳香族化合物，特别是多环芳烃和稠环芳烃用荧光检测有极高的灵敏度，在环境监测方面用处极大。许多生化物质，如有机按类、维生素、激素、酶等到对荧光检测器也有很高的灵敏度。在生命科学研究中，荧光检测器也是不可缺少的工具。
    以上所提到的这些种类的化合物的分子中的电子被激发后能吸收多余能量到达更高能阶，所以用荧光检测器检测。
    苯丙氨酸是人体内必需的氨基酸，主要由膳食途径供给，人体内不能合成。苯丙氨酸除了被用于合成蛋白质外，主要是代谢生成酪按酸，仅有少部分经转按酶作用生成苯两酮酸：
    若人体先天性缺少苯丙氨酸羟化酶，不能殷苯丙按酸氧化成酪氨酸，血中积聚了过量的苯丙按酸，经转氨酶作用氧化成代谢物苯丙酮酸。这些异常代谢物—苯丙酮酸从尿中排出，称为上腺素含量降低，皮肤及毛发颜色浅、智力停留在儿童水平，寿命缩短。究其原因，一方面高浓度的苯丙酮酸聚集于中枢神经，抑制了谷氨酸脱羧作用，影响了神经介质-氨基丁酸的合成；另一方面苯丙酮酸可能抑制了另一种神经介质-羟色胺的合成。
    临床上需要测定血中苯丙氨酸水平，以确诊苯丙酮尿症及观察正在接受治疗的苯丙酮尿症病从血清中苯丙氨酸水平的变化。对于新生儿苯丙氨酸的筛查尤为重要，是预防和治疗先天性代谢疾病——造成儿童智力低下的苯丙酮尿症的有效办法。尽管苯丙酮尿症的发生率仅为万分之一，但我国人口若悬河基数大，进行此项工作有重要意义。患苯丙酮尿症的新生儿经早期治疗，早期禁食含苯丙氨酸的膳食，早期进行特殊的教育，可收到良好的效果。
    测定血中苯丙氨酸含量的更好方法是HPLC-荧光检测器测定法，对于新生儿仅需脐带血200～300uL。利用L-亮氨酰-L-丙氨酸二肽存在使水合茚三酮和铜离子与苯丙氨酸缩合成很稳定的荧光物质。采用反相色谱梯度洗脱方法，ex为365～390nm,em为489～515nm。测定结果表明：
    正常人血清苯丙氨酸含量，成人为（95±20）unol/L;婴儿为（74±25）unol/L。如果血清中苯丙氨酸的含量大于250unol/L，可视为患有苯丙氨酸代谢的遗传性缺陷症。