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如何保养和使用HPLC柱

2010-12-27

如何保养和使用HPLC柱
在使用过程中色谱柱的柱效不断下降，N不断减小，色谱峰越来越不对称，形成严重拖尾峰，柱压也在不断升高。这一切的魁祸首就是填料微粒的形状发生了改变。
填料自身的溶蚀，改变微粒间的堆砌形状，形成塌陷；变得不规则，越来越小；流动相和样品物质逐渐被子微粒吸附，阻塞了微粒间的孔道，变的也越来越小。所以引起压力明显升高。
柱填料的改变必然引起柱头形状的改变，从而引起色谱峰形的改变。
一根色谱柱可能分析数千个样品后性能仍然良好，也可能分析数个样品后就不行了，有众多因素影响色谱柱的寿命。所以要正确使用色谱柱，注意以下5个方面。
第一，加保护柱
保护柱是短柱，不超过3cm，加在分析柱前。要求保护柱的内径与分析柱的内径相同，两柱填装的填料也相同。如分析住使用C18键合相填料，保护柱也用键合相填料，但保护柱填料的粒度比较大。分析柱常用5um的填料，保护柱一般用10—20um的填料以减少压力的增加。
保护柱中的填料的化学成分可以预饱和流动相，减少分析柱中同种填料的溶蚀；保护柱收集流动和样品中垃圾，减少分析柱的污染与阻塞。
加了保护柱增加系统压力，增宽了色谱峰的宽度，使用恰当可以避免这些不得因素。
分析50～100个样品可能就要新保护柱了。如果样吕“脏”可能换得更勤。商品保护柱由柱套和柱芯组成，只要换上新柱芯就行了。换下的旧柱芯要扔掉，防止再用。
第二，避免高压冲击
色谱柱经得起高压，但经不起突然变化的高压冲击。进样阀的转动缓慢，泵启动快，多柱间的切换都引起突然的高压，对色谱柱的柱床和色谱柱的配件会产生损坏。
转动六通进样阀从“装样”到“进样”的蹭瞬时切断流动相的流动，在阀的泵侧压力升高，在阀的柱侧压力降低转到位后一个压力冲击。前面已婚介绍在进样器的泵到柱之间安装压力旁路支管可以缓解压力冲击，但支管的流速受到限制，要求转动进样阀的动作要快。
泵的启动不应太快。如选用3mL/min的流量极要一下子开到3mL/min,先1mL/min，再到2mL/min，然后3mL/min，每个改动的间隔大于30s
第三，选用温和的色谱条件。
多数色谱柱有很宽的实验条件范围，但在具有使用中诸多条件叠加在一起，如pH、温度、流动相种类等，使受到限制。
以硅胶为载体的键合相填料要求使用的流动相pH值在2.5～7.5之间，低于pH2的流动相可能在载体硅胶和键合的硅烷之间发生水解反应，使烷链掉下来；高于pH7的流动相可能溶蚀载体硅胶。结果非碱性组分的保留不断减少，碱性组分的保留增加，峰变宽。
已有键合相填料的新产品可在pH14的流动相中使用。
以硅胶和以硅胶为载体的键合相填料、阴离子交换填料的色谱柱超过60℃后，会增加对流动相中化学物质的吸附。高温下会引起小颗粒填料柱柱床塌陷，降低柱效，改变峰形。40℃以上使用3um填料，70℃以上使用5um填料柱，会使N降低50%。
HPLC柱的使用柱温要求恒定，要求加色谱柱恒温箱，不要让色谱柱放在裸露的自然环境中，下面以实验例说明柱温对色谱分离的重要性。
①柱温对色谱峰形的影响均匀恒定的柱温使色谱峰形对称，狭窄，杯拖尾。色谱柱温不均匀使色谱峰形变宽、拖尾。
②柱温对保留的影响用75℃和54℃两种柱温和相同的色谱条件分离同一种样吕，后一个色谱峰的保留时间分别为10min和13min，54℃柱温的tR增加了26%，在约1℃增加tR1%～3%。如果柱温处在室温下，按上面的推算，晴天（25°）某组分tR为15min，阴天（21°），气温下降4℃，取折中（1℃增加tR2%），某组分tR为16min10s，保留时间增加了1min10s.
③柱温对色谱峰选择性的影响从75还发现柱温54℃时；峰2（硝基乙烷）tR为120s，峰3（m-邻苯二甲酸）tR为2min45s，峰5（4-氯丁烷）tR为4min25s，峰6（3-氰基苯甲酸）tR为6min50s。柱温75℃时：峰2tR为1min40s，峰3tR为1min55s，两峰的Rs变差；6tR为4min20s，峰5tR为4min40s，两峰的Rs变差，与柱温54℃相比，峰位也发生了改变，峰5（4-氯丁烷）跑到峰6（3-氰基苯甲酸）后面了。
④流动相温度与柱温不一致对分离的影响现在已普遍使用色谱柱的恒温装置，但会忽略保持流动相温度与谱柱温度的一致。
第四，净化样品
净化样品的概念不同于样品预处理，意指HPLC样品通过预处理等程序后，在进样前还要净化样品。用特指的溶剂或流动相溶解、稀释色谱样品，多数化学物质（包括要分离的组分）都能溶解成澄明的样品溶液，进入色谱柱后还会流出来，不会对色谱柱造成危害。如果样品含有固体颗粒沉淀，样品浑浊不透明，样品中有絮状物，这种“脏”样品中的颗粒会磨损六通进样阀中的转子，导通转子上的三个导槽。在六通进样器分曾通过。
“脏”样品对色谱柱的分离效能和色谱柱寿命影响也很大工业，有些物质不可逆地吸附在填料表面上会增加柱压，降低柱效，色谱峰形变差、变坏，改变组分的保留参数。即使在分析柱前加了保护柱，而“脏”样品会使保护柱很快阻塞，系统压力很快升高。
用针头过滤器过滤样吕可以滤除样品中90%以上的杂质，能有效地保护进样阀和色谱柱。针头进样器如：两片带管子的塑料圆盘中间紧压一层过滤膜，过滤膜孔＜5um。用前选用进样针筒吸水冲洗针头过滤器，然后用甲醇，再用流动相冲洗，后用进样针筒吸取样品后通过针头过滤器过滤样品准备进样。
第五，用后冲洗色谱柱和整个HPLC系统。
每次工作结束后用强溶剂冲洗柱和色谱系统是一个良好的习惯。用正相色谱法分析样品后可用配制原流动相的主要试剂（去掉酸、碱、离子化合物等到）加5%甲醇冲洗。例如分析用的原流动相为正已烷三氯甲烷-氯水（体积比为：98：1.6:0.5),冲冲洗中去掉0.5%的氨水，加进5%的甲醇。不含有氨的下已烷-三氯甲烷冲洗液，因“记忆”效应很快带走色谱柱和色谱系统中的氨。强溶剂甲醇能有效地冲去留在柱上的强吸附成分。
同样，用反相色谱法分析样吕后用去掉酸、碱、盐的配制原流动相的主要度刘作为冲洗液。如分析用的原流动相为水-甲醇-磷酸盐缓冲液（40：60：0.01），就用水-甲醇（40：60）做冲洗液，很快去除系统中的磷酸盐，后改用水-甲醇（90：10）冲洗。
冲洗过的色谱柱和色谱系统不会因盐类析出晶体阻塞管道、接头，污染检测器池窗，也不会因分析生物样品后蛋白质等沉淀被柱吸附，降低分离效能，也防止色谱系统内霉菌和藻类繁殖、生长。